抗菌肽

抗菌肽（antimicrobial   peptide）抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质。其是氨基酸数目小于100的一类小肽，多由20～60个氨基酸残基组成，分子质量在2000～7000，常带正电荷，多数具有强碱性、热稳定性， 并具广谱抗菌性。

1962年基斯（Kiss）和 米希尔（Michl）从铃蟾皮肤分泌物中发现具有抗菌且溶血作用的肽类，并且最终从中分离出了含有22个氨基酸的抗菌肽，人们由此了解到蛙皮具有抗菌作用，是由于其中含有抗菌肽之类的活性物质。1972年，具有抗菌且溶血作用的肽类从蜜蜂毒液被分离出来。此后，人们对这类阳离子抗菌肽的结构与作用机理进行了深入研究。

20世纪80年代初，瑞典斯德哥尔摩大学的汉斯 ·鲍曼（Hans Bowman）首次从蝴蝶身上分离出一类具有很强抗菌能力的肽，后来，法国斯特拉斯堡分子和细胞生物研究所所长，苍蝇和蝴蝶研究专家，法兰西科学院院士儒尔 ·霍夫曼（Jules Hoffman）证实了这些肽的存在。他们用事先浸泡在细菌培养液中的针头对昆虫进行注射，发现细菌对昆虫没有产生任何影响，而在12～24h以后，昆虫产生了大量的抗菌肽。霍夫曼和他的同事还发现，仅果蝇一种昆虫，就可产生7种抗菌肽。

蒂马克先生于1999年1月创建了Entomed公司，目的是用昆虫产生的自然物质研制新型肽。公司成立后，对昆虫抗菌肽的研究经取得了许多进展，如从一种热带小蝴蝶身上提取了一种抵抗曲霉病非常有效的分子，并在老鼠身上进行了试验。Entomed公司研究了200种昆虫，如瓢虫、金龟子等，从未发现有相同的肽分子。研究人员将几十年内发现的700多种抗菌肽分为两类，一类是非核糖体合成的抗菌肽，另一类是由核糖体合成的天然抗菌肽。这些肽类是由基因编码、宿主细胞产生的一类抗菌分子，是有机体在进化过程中为适应环境、求得生存而最早产生的免疫活性分子，其分子量较小， 一般在4000Dr左右，肽链在几十个氨基酸残基左右，被认为是天然免疫的重要介质。

抗菌肽的理化性质主要有以下几点：

• 分子质量小（2000～7000），氨基酸数目小于100，多由20～60个氨基酸残基组成。

• 热稳定性高，100℃加热10～15mim，其仍能保持一定的活力。

• 水溶性好。

• 常带正电荷，等电点(pI)一般大于7，具有较强的阳离子特征。

• 多数具有强碱性。

• 能与宿主体内某些阳离子蛋白、溶菌酶或抗生素协同作用。

• 能与细胞脂多糖结合。

抗菌肽按来源可分为：昆虫抗菌肽，两栖类抗菌肽，水产动物抗菌肽，哺乳动物抗菌肽，植物抗菌肽以及微生物抗菌肽。

昆虫抗菌肽是指昆虫在受到X和感染的时候，由昆虫血淋巴产生的一类具有光谱抗菌活性的多肽类物质。昆虫中抗菌肽的种类较多，也非常复杂。研究者在昆虫中发现的抗菌肽类物质已超过1700种。

• 天蚕素

天蚕素类抗菌肽研究主要集中在鳞翅目和双翅目昆虫，已分离出20多种天蚕素类抗菌肽。1972年，瑞典科学家博曼（H.G.Boman）等首次用阴沟肠杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕，从其血淋巴中分离出3种具有抗菌活性的蛋白（溶菌酶、天蚕素A和天蚕素B）。霍尔马克（D.Hultmark）等在1982年又从惜古比天蚕中分离鉴定了4种天蚕素抗菌肽，即天蚕素C、天蚕素D、天蚕素E和天蚕素F。

• 昆虫防御素

昆虫防御素分布广泛，已在半翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、蜻蜓目中发现了15大类，40多种该类抗菌肽。比如包括来自果蝇的防御素和来自麻蝇的麻蝇防御素、麻蝇防御素B 、麻蝇防御素C等。

• 富含脯氨酸的抗菌肽

这类抗菌肽是卡斯蒂尔斯（Casteels ）等于1989年从膜翅目的意大利蜂血淋巴中首先发现的，研究人员在双翅目、膜翅目、半翅目和鞘翅目中也发现这一类抗菌肽，如来自蜜蜂的蜜蜂抗菌肽和来自果蝇的果蝇菌素以及来自红蝽的富脯氨酸抗菌肽等。大部分这类抗菌肽主要抑制革兰阴性菌，而对革兰阳性菌则无作用。

• 富含甘氨酸的抗菌肽

这类抗菌肽包括来自天蚕的天蚕抗菌肽A-F，来自家蚕的抗菌肽，来自麻蝇的麻蝇毒素IIA、麻蝇毒素IA、麻蝇毒素IB、麻蝇毒素IC和来自果蝇的抗菌肽等。该类抗菌肽杀菌机理是阻碍细菌肽聚糖和外膜蛋白的合成，干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白以及基因的转录使这些蛋白的含量减少，从而导致细菌细胞膜的通透性增加，细菌的生长因而受到抑制，但其只对生长中的细菌起作用。

哺乳动物抗菌肽研究虽然起步晚，但已经至少从8种哺乳动物包括牛、羊、猪、鼠、犬、兔、恒河猴和人体中分离纯化或克隆得到数百种哺乳动物上皮细胞抗菌肽及其他抗菌肽。其中，已经从猪、恒河猴和牛体内分别发现了至少13种不同的抗菌肽，绵羊抗菌肽包括3类共11种。

两栖动物有自己的一套先天性免疫系统，其核心是抗菌肽。两栖动物皮肤被公认为是生物活性多肽的储存库。两栖动物蛙的皮肤中分离到的蛙皮素，它不仅作用于革兰氏阳性及革兰氏阴性菌，对真菌及原虫也有杀伤作用。

水产养殖品种生活于富含各种各样微生物的水环境中，长期的生存适应使其形成了有效的防卫功能。抗菌肽被认为是鱼、虾、贝等防御素系统的主要成分之一。随着对水产养殖品种抗菌肽的分离、结构与功能的研究，改造并合成既具有稳定高效抗菌活性又具有特异抗菌能力且对宿主无害的抗菌肽基因，并通过基因工程在原核细胞、真核细胞或 某些藻类中进行表达，以实现批量生产，将有希望成为对付水产养殖品种病原体特别是耐药菌的新型药物。

抗菌肽是植物非特异性天然免疫系统的一大组分。已发现的植物抗菌肽都富含半胱氨酸，并且所有的半胱氨酸都形成分子内二硫键。大部分植物抗菌肽是从植物种子中分离获得的，它们可以保护植物组织和种子不受真菌病原菌的侵害，但是大部分植物抗菌肽对大部分细菌无抑制活性。典型的植物抗菌肽是大麦中的硫素肽，能杀伤多种酵母和细菌。也有专家从蚕豆这种豆类植物中获得了植物抗菌肽，但其只对革兰氏阳性和阴性细菌有效，对酵母无效。

细菌抗菌肽能特异性杀死竞争菌，而对宿主自身无害。大部分细菌抗菌肽是通过改变细胞膜的通透性来杀死竞争菌，也有少数是通过阻断细胞生命物质的合成来杀死竞争菌。细菌抗菌肽包括阳离子肽和中性肽，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有分泌。

病毒抗菌肽精氨酸含量高，不含赖氨酸，具有抗菌活性和细胞毒作用。

根据抗菌肽的结构可将其分为5类：单链无半胱氨酸的抗菌肽；富含氨基酸残基（不含胱氨酸）的抗菌肽；有两个或两个以上二硫键，具β折叠结构的抗菌肽；含一个二硫键的抗菌肽以及由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。

单链无半胱氨酸的抗菌肽或由无规则卷曲连接的两段α螺旋组成的肽主要包括天蚕素等，由31～39个氨基酸残基组成，主要为螺旋构象，无胱氨酸，不形成二硫桥，pl为8.2～9.6，N-端区高度正电荷，C-端区为疏水区。对G菌和G菌有强的抗菌活性，且对G菌活性更强，在抗菌浓度下对真核细胞无溶胞作用。

这类抗菌肽富含某些氨基酸残基，但不含胱氨酸，如富含脯氨酸或甘氨酸残基的抗菌肽。札斯洛夫（Zasloff ）等在非洲爪蟾皮肤和胃X腺体上皮细胞中分离到的小分子抗菌肽，命名为蛙皮素。卡斯迪尔斯（Casteels ）等在意大利蜂中发现这种富含脯氨酸的抗菌肽，后来在蜜蜂、果蝇等昆虫中也陆续发现。这类肽带正电荷，可分为两类： 一类是小分子肽类，由15～43个氨基酸残基组成，都含有精氨酸-脯氨酸或赖氨酸-脯氨酸氨基酸对结构；另一类是分子质量较大的肽，由83个氨基酸组成。这类抗菌肽对G菌有抗性，而对G菌无作用。

有两个或两个以上二硫键，具β折叠结构的抗菌肽主要包括防御素等。防御素是美国Leherer实验室首次从兔肺巨噬细胞中分离到的两个阳离子性极强的小分子抗菌肽。大多数防御素由38～43个氨基酸残基组成，带有一个净正电荷，含有6个位置保守的半胱氨酸并构成3个分子内二硫键，二硫键与抗菌活性密切相关。山口（Yamauchi）指出昆虫防御素是由29～34个氨基酸残基组成的多种阳离子肽，酶活性为4ku左右，均具有特征的反向平行β折叠结构，富含胱氨酸，形成2～3对分子内二硫桥。昆虫防御素对G菌有强的抗菌活性，但对G菌的抗菌活性较弱。实验证明，分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要。

含一个二硫键的抗菌肽，其二硫键的位置通常在肽链C端 。

由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽，根据其来源不同又被分为两类，一类是非核糖体合成的抗菌肽，如短杆菌肽、多粘菌素、杆菌肽和糖多肽等，主要是由细菌产生，并经结构修饰而获得；另一类是由核糖体合成的天然抗菌肽，是生物机体抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类抗微生物与一些恶性细胞的短肽。

抗菌肽多数具有广谱抗菌的特点，某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒和癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。

抗菌肽对革兰氏阳性及革兰氏阴性菌均有高效广谱抗菌作用，至少有113种不同的细菌均能被抗菌肽所杀灭。例如，人源乳铁蛋白及其衍生物可以减轻小鼠泌X大肠杆菌引起的感染和炎症等。

最先发现对真菌有杀伤作用的抗菌肽是从两栖动物蛙的皮肤中分离到的蛙皮素，它不仅作用于革兰氏阳性及革兰氏阴性菌，对真菌及原虫也有杀伤作用。防御素是一类从动物细胞中分离到的杀菌肽，主要存在于吞噬细胞中。具有很宽的抗菌谱，对真菌及部分真核细胞都有一定的杀伤作用。天蚕素及其类似物，如天蚕素-蜂毒素杂合肽对感染昆虫的真菌具有一定的杀伤作用。来源于人和灵长类动物唾液的组蛋白也有抗真菌的作用。

抗菌肽可以有效地杀灭引起人类及动物寄生虫病（如疟疾、利什曼病等）的寄生虫。已发现一种合成的天蚕素-蜂毒素杂合肽对利什曼原鞭毛虫有杀伤作用。

抗菌肽作为在自然界普遍存在的必要保护工具，抵抗着各种病原，部分抗菌肽对锥虫、疟疾虫和线虫有杀伤活性。

蜂毒素和天蚕素在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制 HIV-1病毒的增殖。蜂毒素-2与合成肽对疱疹病毒HSV-1和HSV-2有一定的抑制作用，此外，人源性的A2防御素1～3对CD8T细胞分泌的CD8抗病毒因子抗HIV21活性有贡献。 来源于猪白细胞和来源于绵羊抗菌肽有很强的抗苍白螺旋体的作用。

 抗菌肽对正常动物细胞无杀伤作用，但是，对于癌细胞则有明显杀伤作用。抗菌肽对体外培养的癌细胞的作用主要是使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体出现空泡化，嵴脱落。核膜界限模糊不清，有的核膜破损，核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成，细胞骨架也受到一 定程度的损伤。

抗菌肽能与细胞多糖结合，具有中和毒素的作用，因此对革兰氏阴性菌败血症和内毒素中毒性休克具有很好的防治作用。

关于抗菌肽的作用机理已研究得较多，但仍未十分明了。关于抗菌肽的作用机制主要有以下几种说法：离子通道的形成；抑制细胞呼吸；抑制细胞外膜蛋白的形成；抑制细胞壁的形成。其中，比较公认的作用机制为离子通道的形成模式。

离子通道的形成模式认为抗菌肽通过在细胞膜上形成离子通道造成细菌内容物大量外泄而致细胞死亡。因为在组成抗菌肽分子的氨基酸中，大多数为带正电荷的氨基酸。抗菌肽分子首先通过静电作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入细胞膜中的疏水区域，通过改变膜构象，多个抗菌肽聚合在膜上形成离子通道，造成细胞内容物泄露致细胞死亡。

研究表明，抗菌肽并不作用于高等动物细胞，这可能是由于高等动物细胞膜中的胆固醇阻碍抗菌肽的疏水面插入磷脂双分子层；也可能是由于微生物与高等动物细胞膜的膜外结构的区别：高等动物细胞膜外表面的唾液酸与膜的距离有8nm，它可能与抗菌肽的带正电区结合而阻止其接近细胞膜发挥杀伤作用。

抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，对某些耐药菌具有杀伤力，而且细菌对之不易产生耐药性。此外，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。抗菌肽的广泛生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景，在临床上已经得到广泛应用的有多黏菌素、杆菌肽、X拉宁等。

黏杆菌素是阳离子脂肽多黏菌素E的一种甲硫衍生物，应用其气雾剂治疗肺部绿脓杆菌感染已取得成功。从柞蚕蛹免疫血清中分离抗菌肽并经喷雾干燥制成“育成蛹粉” ，作为“肾肝宁”的原料，再加入适量牛膝流浸膏，配制成胶囊，治疗肾炎及肝炎有较好疗效。这种抗菌肽，经冷冻干燥制成天蚕素粉，经试验证实能抑制鸭乙型肝炎病毒DNA 的复制，同时临床试验证实对乙型肝炎有较好疗效，除对转氨酶等指标恢复正常外，能使肝炎表面抗原转为阴性。抗菌肽还用在在治疗胃、十二指肠溃疡及肠癌等方面。抗菌肽可用在在口腔及X消毒杀菌剂方面。试验证明抗菌肽清洗剂对耐药性大肠杆菌、金黄葡萄球菌、绿脓杆菌及白色念珠菌等均能达到99.9%的杀灭效果，对人安全，无毒副作用。

抗菌肽被应用到植物抗病基因工程中，通过分离并克隆蚕类抗菌肽的基因，然后将它们导入植物体内，这可能将会增强植物的抗病能力。如用将抗菌肽B基因转入广藿香的组织细胞，在筛选培养基上经过丛芽途径获得转基因植株获得高水平表达，产生较强的抗病效果。华南农业大学与复旦大学合作设计合成抗菌肽D基因，并将其转化于根癌农杆菌， 再感染烟草子叶，经过组织培养成菌，研究证明抗菌肽基因能稳定地遗传到子代并具有较强抗病力。将抗菌肽基因导入桑树、桉树、 番茄、辣椒等均获得抗病的后代。

蚕抗菌肽作为一种广谱、高效、无残留的新型抗微生物药物在畜牧业中使用，有明显的优势和前景。抗菌肽基因设计，合成获得多个新的基因，经提纯后的抗菌肽醇母作为饲料添加剂，饲喂仔猪、小鸡，能预防、治疗消化道炎症，有较好的效果。

蚕抗菌肽分子质量小，结构高度紧密，而且具有广谱的杀菌活性，对与食品有关的多种革兰氏阴性和阳性细菌均有较强的杀灭作用。而且蚕类抗菌肽表现出良好的热稳定性，因此可用于食品的热加工。蚕抗菌肽还可用于食品发酵中的杂菌污染，除了直接添加抗菌肽以外，还可把抗性基因转入发酵菌株。抗菌肽抑制微生物的生产是非常迅速的，而且其易被体内的蛋白酶水解消化，对人体无毒副作用。蚕抗菌肽在酸性情况下活性最强，适于大多数酸性食品，尤其是饮料的防腐，有良好的溶解性和稳定性。因此，可以说蚕抗菌肽是一种对人体无毒副作用的新型食品防腐剂。

抗菌肽对皮肤防治表面及深层的致病细菌及真菌、对保护皮肤有良好作用。以抗菌肽、表皮生长因子及胎牛血清素复配，能有效地清洁肌肤、补充营养、调控肌肤新陈代谢、激活表皮细胞生长等功效。

以猪小肠上皮细胞抗菌肽制备工艺为例来介绍天然抗菌肽提取及抽提方法。

• 猪小肠上皮细胞抗菌肽粗提物制备：乙醇室温浸提猪小肠上皮细胞24h，过滤除去沉淀，冷冻干燥得到粗提物。

• 纯化：采用3步层析技术对冷冻干燥粗提物进行纯化：离子交换层析——用琼脂糖凝胶进行纯化——重复进行3次快速蛋白质液相色谱纯化。

以杆菌肽的发酵工艺为例来介绍以发酵法生产抗菌肽的生产方法：杆菌肽发酵生产使用地衣芽孢杆菌，在以淀粉、黄豆饼粉为主要碳、氮源的液体培养基中进行通气培养，经发酵生物合成杆菌肽。杆菌肽发酵液经草酸酸化，通过板框过滤除去菌体、碱性蛋白、钙镁离子、培养基残渣等杂质，再用碱中和得到符合离子交换工艺要求的杆菌肽原液。原液经树脂提取、萃取提纯、喷雾干燥最终得杆菌肽成品。

基因工程制备抗菌肽的方法是：通过基因工程将目的抗菌肽基因序列克隆出来，插入特定的表达载体，再转染至特定的表达系统，进行人工的诱导表达。在生物工程领域中，异源或重组抗菌肽的最常用最主要的表达系统根据受体细胞区分，主要有三种，即原核的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌表达系统、低等真核的酵母表达系统和高等真核的哺乳动物细胞表达系统。

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