基于自组装的翻译后蛋白振荡器

蛋白振荡器在从原核生物到人类的生物中起着重要的调节作用。在大多数已知的生物学情况下，振荡是通过转录/翻译循环实现的。在生物学（已发现纯粹的翻译后振荡器的几个例子1，2）。同时，翻译后蛋白质电路在合成应用中也越来越受到追捧，因为它们具有显示出对环境变化更快的响应，允许对电路行为进行更直接控制，与功能输出直接耦合，并且可以在不包含庞大遗传工具的情况下使用（3 – 5）。虽然近来的显著工作使合成的翻译后的基于蛋白质的逻辑门（设计4，5），工程可调动态现象，例如在合成的翻译后上下文振荡仍然是一个杰出的挑战（6，7）。

研究得最好的生物翻译后蛋白振荡器的例子是蓝细菌中的KaiABC系统（8）。通过仅放置蛋白KAIA，KaiB和KaiC在试管，具有丰富的三磷酸腺苷以来，KaiC蛋白统称得到依次磷酸化并去磷酸化，形成的振荡周期（9，10）。虽然KaiC蛋白通常以六聚体状态存在，但单体仅在振荡周期的某个阶段才在六聚体中改组（11）。KaiABC系统证明蛋白质振荡器无需使用转录/翻译循环或大量成分即可实现振荡行为。

受KaiABC系统的激励，我们着手设计一种基于蛋白质的振荡器，该振荡器可以在体外仅使用少量相对较高拷贝数的成分进行重构，因此产生的任何振荡都不是随机的。为了便于将来将这一理论研究转化为实验系统，我们基于生化约束条件和可通过计算蛋白质设计进行导航的设计空间来构建系统架构。我们将动力学反应网络限制为仅包括三种蛋白质，并且仅允许可逆结合和磷酸化/去磷酸化酶反应。

像KaiABC中一样，振荡系统将在蛋白种类是否被磷酸化的周期中循环。当靶蛋白被磷酸化时，磷酸化必须诱导改变，以沿着振荡周期推进整体状态。这种变化可以通过以下两种方式之一来影响激酶和磷酸酶的酶动力学来实现：改变靶蛋白的构象或直接修饰激酶和磷酸酶。我们首先考虑不修饰激酶或磷酸酶的系统。

最简单的此类系统，即一个带有一个磷酸化位点的蛋白被激酶和磷酸酶修饰的蛋白，无论参数选择如何，都不会产生振荡（7）。当包含两个磷酸化位点时，只有在四个可能的磷酸化态的每个具有随后的磷酸化和去磷酸化速率显着不同的假设下，振荡才可能发生（7）。虽然生物学似乎已经在KaiABC中设计了一个系统，该系统能够经历实现这种形式的振荡所必需的许多构象变化（9），但是从相同序列设计甚至两个（更不用说几个）蛋白质结构仍然是一个重大挑战。计算蛋白设计领域（12）。

这些挑战不是具有两个磷酸化位点的分子所独有的。例如，由于具有两个磷酸化位点的分子的振荡是通过酶螯合（7），我们考虑一个分子，该分子包含一个磷酸化位点以及一个激酶或磷酸酯酶-酯化域（或本身包含酶结合域的外部化合物的结合域）。这些系统能够产生振荡，但前提是磷酸化和结合伴随分子中显着的构象变化，从而改变后续反应的速率常数。即使假设设计了这种构象变化，我们也没有发现这些系统在典型的结合/未结合速率常数以及典型的激酶和磷酸酶活性（即催化速率和米氏常数k _cat和ķ_中号，下面将进一步讨论）。

因此，专注于酶本身修饰的系统更可能成为产生实验上可实现的振荡的候选者。生物学发现了几种将磷酸化与酶促活性联系起来的方法。从概念上说，最直接的方法是使酶的活性取决于其自身的磷酸化状态（13），这在计算蛋白质设计的背景下仍然是一项挑战（14）。然而，该领域已经取得了在蛋白质-蛋白质相互作用（设计显着的成功15），其可通过磷酸化被修改（16，17）。

这一成功的自举了，我们认为蛋白质自组装成多聚体功能的激酶和磷酸酶（18，19）。我们的动机，部分地，通过使用分割蛋白酶来实现翻译后的基于蛋白质的逻辑门（成功4，5）。在我们的设计中，当蛋白质的结合界面被磷酸化时，它们的自组装受到阻碍，从而降低了系统中可用功能酶的浓度。

因此，通过两个相反的因素的推动和振荡来实现振荡：自组装激酶通过使激酶和磷酸酶单体磷酸化来抑制新蛋白质的自组装；同时，自组装磷酸酶抵消了这种抑制作用。已知诸如此类的非相干输入可增强振荡（20）的鲁棒性。我们的整体振荡器的设计是通过类比动机已知的成功的振荡器，特别是双反馈遗传振荡器（1，21 – 23）。正如该振荡器依赖于LacI抑制作用与AraC激活作用之间的相互作用一样，我们的振荡依赖于激酶和磷酸酶多聚体之间的相互作用，后者分别抑制和激活其自身的自组装。